1 实验背景

蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。是分子生物学、生物化学和免疫遗传学等众多学科领域中常用的一种检测特异蛋白质表达水平的实验方法，传统手工方法操作时间久，结果稳定性差，为了解决这些问题，捷美自主研发了一款AW-12全自动清洗工作站，代替繁琐、重复、枯燥的手工实验过程，自动化实现制冷低温储存、封闭、孵育、洗膜、回收一抗和二抗的整套Western blot孵育流程。实验结果表明，AW-12的显影效果完全可以达到传统手工得到的效果，而且比传统手工结果更稳定。

2 实验目的

比较AW-12全自动清洗工作站和传统手工方法操作Western blot实验得出的显影效果，验证仪器使用的可靠性及稳定性。

3 Western Blot

3.1 制胶

3.1.1 准备

先用试管刷蘸取洗洁精洗去玻璃板上污渍，用自来水将板上残留的洗洁精冲洗干净，再用蒸馏水冲洗；先将棉垫垫于配胶板上，玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，然后向其中加满ddH2O静置5min，不漏，倒掉ddH2O,倾斜制胶板晾干。

3.1.2 分离胶

按照表1配制8%分离胶，振荡混匀后用1ml枪沿两块玻璃板间的一角缓慢加入下层胶，枪内胶不要一次性全部加完，注意不能有气泡，加至绿框下缘平行。最后在板内加入无水乙醇，液封。室温下等待30min，待下层胶完全凝固后，倒掉上面的无水乙醇，倾斜制胶板晾干。

3.1.3 浓缩胶

准备好梳子，按照表1配制浓缩胶振荡混匀后用移液枪加至玻璃板上缘，注意不能产生气泡。随从一侧缓慢插入梳子，室温下等待30分钟，待上层胶完全凝固。

3.2 点样和电泳

3.2.1

取下配好的胶置于电泳槽内，从槽中间加入电泳缓冲液，中间倒满没过梳子，外面至相应刻度线即可。平行拔出梳子，用200ul移液枪吹孔，以保证孔内通畅。按照Marker 加2.5ul/孔，蛋白样品加10ul/孔。

3.2.2

盖上电泳槽盖子（注意正负极），电泳起始电压为70V，待其进入到分离胶后调整电压至90V跑至底部结束。

3.3 转膜

3.3.1

在SDS-PAGE即将完成时，制备转膜液，准备好冰块，先将转膜液预制冷，剪取于凝胶大小相当的PVDF膜一张及四张滤纸，PVDF膜于甲醇中浸泡2min左右转移至转膜液中。滤纸及海绵浸泡于转膜液中备用。

3.3.2

按照下面的顺序将膜与滤纸放置在转移装置上：负极→黑色海绵→2张滤纸→凝胶→PVDF膜→2张滤

3.4 封闭和抗体孵育

3.4.1 传统手工方法

3.4.1.1

封闭：准备（贮备）好一个干净的孵育盒，转膜完成后，将PVDF膜完全置于封闭液中（含5%脱脂牛奶的PBST），然后将孵育盒放置于水平脱色摇床上，转速60，室温封闭1h。

3.4.1.2

洗膜：用PBST（含1%的Tween-20）洗膜，转速110，3次，5min/次。

3.4.1.3

一抗孵育：将PVDF膜根据所要目的条带进行剪裁，然后将其加入稀释了适当浓度的一抗（用2%BSA稀释1:1000）中，放置在水平脱色摇床上，转速60，将摇床放进4oC冷库中孵育过夜。

3.4.1.4

洗膜：用PBST洗膜，转速110，3次，10min/次。

3.4.1.5

二抗孵育：加入HRP标记的羊抗鼠和羊抗兔的二抗（5%脱脂牛奶稀释比例1：5000），置于水平脱色摇床上，转速60，室温反应1h。

3.4.1.6

洗膜：用PBST洗膜，转速110，3次，10min/次。

3.4.1.7

最后向孵育盒中加入PBST，将孵育盒放入4℃冰箱中，等待显影。

3.4.2 AW-12全自动清洗工作站的方法

3.4.2.1

准备：

① 提前根据实验需求准备好一抗、二抗试管，以及孵育盒，打开仪器开关，预制冷。

②根据所选择孵育盒的规格准备抗体的量（参见表2），然后将一抗二抗抗体加入对应抗体管中，并将抗体管放进对应的抗体储存位置，孵育盒放进孵育槽中，手动向孵育盒中加入5%脱脂牛奶（加液量参见表2）。

③准备足量ddH2O（洗针液）和PBST（清洗液）于相对应的桶中，及时倒掉废液桶中的废液，以免废液溢出。

3.4.2.2

剪膜：转膜完成后，将PVDF膜根据所要的目的条带进行剪裁，并将其放入对应的孵育盒中，盖上孵育盒盖子。

3.4.2.3

程序设置：

根据孵育盒的选择及所选择的通道（1-12），在显示屏上点击选择对应的通道和孵育盒的规格，仪器根据所选的孵育盒规格提供了默认参数（参见表2），如有需求可以更改参数。程序设置完成后，点击屏幕上的“运行”，程序开始运行。

3.4.2.4

管路清洗：

程序运行结束后，孵育盒始终保持低温状态，手动取出抗体管回收抗体，然后进入管路清洗页面点击“管路清洗”，开始清洗管路。

3.4.2.5

后续直接显影就可关机并把膜取出，若暂时不显影可在运行结束后，让仪器始终保持此状态，孵育盒及抗体储存位置始终保持低温状态。

3.5 显影

将膜取出，置于暗盒中，将适量的ECL发光液（1：1混匀后）均匀地加到膜上，进行胶片曝光。压片，并用显影液和定影液进行手工洗片，待胶片风干后扫描记录实验结果。

4 实验结果与分析

从上面显影结果可以明显看出，应用AW-12全自动清洗工作站可以获得清晰、低背景的结果，其效果完全可以达到或优于传统手工得到的效果，并且仪器可以节省手工操作所花费的时间。

5 客户试用提供显影结果图